F-35B là phiên bản máy bay cất cánh đường bay ngắn và hạ cánh thẳng đứng (STOVL- Short Take-off Vertical Landing). Về kích thước F-35B tương đương với F-35A của không quân, hy sinh một phần lượng nhiên liệu mang theo dành cho hệ thống bay thẳng đứng.
Giống như AV-8B Harrier, pháo trang bị được gắn trong một trụ treo dưới cánh. Bay thẳng đứng là một tính năng thử thách nhất, và sau hết, là yếu tố quyết định trong thiết kế.
Thủy quân lục chiến Mỹ sẽ dùng F-35B để thay thế cho cả hai loại máy bay chiến đấu AV-8B Harrier và F/A-18 Hornet.